Solution III 中和液（500 mL 配制方案）

产品概述

Solution III 是碱裂解法质粒DNA提取流程中的关键中和试剂，通过高浓度醋酸钾（KOAc）与醋酸（CH₃COOH）形成的强缓冲体系，中和Solution II强碱环境，使溶液pH恢复至中性。在pH中和过程中，SDS-蛋白质-基因组DNA复合物发生不可逆沉淀，而质粒DNA因分子较小且呈超螺旋结构，能够快速复性并保留在上清中，从而实现质粒DNA与蛋白质、染色体DNA的高效分离。本品为500 mL规格配制方案，适用于分子生物学实验室质粒提取的中和沉淀步骤。

组分与配方（500 mL体系）

各组分核心功能：

• KOAc（3 M） ：提供高浓度钾离子，与SDS形成不溶性的十二烷基硫酸钾（PDS）沉淀，有效包裹并共沉淀蛋白质与染色体DNA。

• CH₃COOH（5 M） ：迅速中和Solution II的强碱性环境，降低pH至中性范围，使质粒DNA恢复天然构象并保持溶解状态。

配制流程

1. 称取147 g KOAc于500 mL烧杯中，加入约300 mL去离子水。

2. 加入57.5 mL冰醋酸（CH₃COOH） ，搅拌至完全溶解。

3. 用去离子水定容至500 mL，继续搅拌至溶液均匀。

4. 配制完成后室温保存，使用前建议4 ℃预冷。

操作要点与注意事项

1. 使用前4 ℃预冷（强烈推荐）
低温条件可显著促进PDS（十二烷基硫酸钾）沉淀的形成，使蛋白质与基因组DNA的共沉淀更为完全，同时低温还能有效抑制残留DNase活性，保护质粒DNA完整性。建议在加入Solution III前将所需用量提前放置于4 ℃预冷至少30分钟。

2. 加入后必须立即轻柔混匀
加入Solution III后，应立即温和地颠倒离心管6-8次，确保中和反应与沉淀反应充分均匀。若混匀不充分，局部酸碱不均会导致部分质粒DNA被包裹于沉淀中，造成得率明显下降。

3. 操作手法要求

• 颠倒混匀时应动作温和，避免剧烈振荡导致基因组DNA剪切断裂后混入上清，影响质粒纯度。

• 混匀后可见体系中出现大量白色絮状沉淀（PDS-蛋白质-基因组DNA复合物），此属正常现象。

4. 裂解-中和时间控制
加入Solution III的时间点应在Solution II裂解3-5分钟内完成，裂解时间过长会导致质粒DNA碱变性不可逆，无法在中和步骤中有效复性。

5. 中和后处理
中和完成后应立即进入离心步骤（12,000 rpm，10 min），将沉淀与含质粒DNA的上清分离，避免沉淀长时间接触上清导致质粒DNA被吸附损失。

应用场景

本品适用于碱裂解法质粒DNA提取中的中和与沉淀步骤，用于中和经Solution II裂解后的细菌裂解液，并通过PDS沉淀体系有效去除蛋白质与基因组DNA。经离心后，质粒DNA留存于上清液中，可进入后续纯化步骤（如醇沉淀、柱吸附等），完成高纯度质粒DNA的提取