免提取核酸释放剂：原理、配方与操作全解
做过核酸检测的朋友都懂——提取核酸那一步简直噩梦：离心、洗涤、过柱、洗脱，一套下来少说半小时起步，样本一多手都酸了。更别提提取过程中RNA容易降解、DNA可能损失、样本之间还有交叉污染的风险。
免提取核酸释放剂的出现，就是为了解决这个问题。但市面上产品配方各异，核心逻辑却高度一致。今天把裂解原理、配方设计逻辑、操作关键点拆透——帮你选对用对。
一、核心逻辑：三步“裂-释-稳”
免提取核酸释放剂的核心功能可以概括为三个字：
| 功能 | 实现方式 | 通俗理解 |
|---|---|---|
| 裂（裂解） | 表面活性剂破坏细胞膜/病毒包膜及核衣壳蛋白 | “拆门破墙” |
| 释（释放） | 碱性环境破坏蛋白结构，使核酸从蛋白复合物中脱离 | “把核酸拽出来” |
| 稳（保护） | EDTA螯合金属离子，抑制DNase/RNase；海藻糖在核酸表面形成保护层 | “给核酸穿盔甲” |
与传统提取的核心区别：传统方法追求“纯化”（核酸与其他组分分离），释放剂追求“释放”（核酸从细胞/病毒中出来即可）。释放剂牺牲了一定的纯度，换来了速度——从30分钟压缩到5-10分钟。
二、配方设计的底层逻辑
市售核酸释放剂的配方虽有差异，但核心功能模块高度一致。以下汇总了多方专利文献中的常见成分及其作用：
| 功能模块 | 常见原料 | 核心作用 | 参考浓度 |
|---|---|---|---|
| 表面活性剂 | Triton X-100、Tween-20、SDS | 破坏细胞膜/病毒包膜及核衣壳蛋白，裂解释放核酸 | Triton/Tween: 0.1%-2%（v/v）；SDS: 0.01%-0.5% |
| 碱性剂 | NaOH、KOH | 碱性环境破坏蛋白结构，辅助核酸变性释放 | 弱碱体系：0.005%-0.05%（w/v）；强碱体系：0.1-0.4 mol/L |
| 缓冲体系 | Tris-HCl | 稳定pH，为核酸提供适宜保存环境 | 10-100 mM |
| 螯合剂 | EDTA | 螯合金属离子，抑制DNase/RNase活性 | 1-30 mM |
| 核酸保护剂 | 海藻糖、PEG8000、BSA | 在核酸表面形成保护层，维持核酸稳定 | 海藻糖0.05-0.5M；PEG8000 0.1%-2% |
| 盐类 | NaCl、KCl | 调节离子强度，优化核酸释放与PCR兼容性 | 20-200 mM |
| 还原剂 | DTT、β-巯基乙醇 | 打断蛋白二硫键，辅助裂解 | 10-50 mM |
⚠️ 技术路线选择——两条路不可混配
市售核酸释放剂主要有弱碱-Triton体系和强碱-SDS体系两条技术路线，成分和浓度差异巨大，配制时需选定一条完整路线，不可跨体系随意混配：
| 对比项 | 弱碱-Triton体系（推荐） | 强碱-SDS体系 |
|---|---|---|
| 碱性剂 | NaOH 0.005%-0.05% | KOH 0.1-0.4 mol/L |
| 表面活性剂 | Triton X-100 0.1%-2% | SDS 0.01%-0.5% |
| PCR兼容性 | 较好，可直接取用 | SDS抑制强烈，需稀释5-10倍 |
| 适用样本 | 病毒、拭子、体液等简单样本 | 细菌、环境样本等复杂样本 |
不同表面活性剂的PCR兼容性差异
| 表面活性剂 | PCR兼容性 | 建议操作 |
|---|---|---|
| Triton X-100 / Tween-20 | 兼容性较好 | 可直接取用 |
| SDS | 抑制强烈 | 裂解后建议稀释5-10倍再扩增 |
不同样本类型的碱浓度优化（弱碱体系）
| 样本类型 | 推荐NaOH浓度 | 说明 |
|---|---|---|
| 病毒、拭子样本 | 0.005%-0.01% | 包膜较薄，低浓度即可 |
| 革兰氏阴性菌 | 0.01%-0.02% | 外膜较薄 |
| 革兰氏阳性菌、环境样本 | 0.02%-0.05% | 细胞壁厚，需更高浓度 |
三、配制方案（以弱碱-Triton体系为例）
以下为一种典型的免提取核酸释放剂配制方案（参考专利CN112522370A等文献）：
核心配方（配制100 mL）
| 组分 | 终浓度 | 用量 | 说明 |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl（pH 8.0） | 10-50 mM | 1-5 mL（1M母液） | 缓冲体系 |
| EDTA（pH 8.0） | 1-5 mM | 0.2-1 mL（0.5M母液） | 螯合剂 |
| Triton X-100 | 0.5%-1%（v/v） | 0.5-1 mL | 非离子表面活性剂 |
| 海藻糖 | 0.1-0.5 M | 3.8-19 g | 核酸保护剂 |
| PEG8000 | 0.5%-1%（w/v） | 0.5-1 g | 核酸保护/促沉淀 |
| NaOH | 0.01%-0.05%（w/v） | 0.01-0.05 g | 碱性裂解剂 |
| 无酶无菌水 | — | 定容至100 mL | 溶剂 |
配制步骤
| 步骤 | 操作 | 关键要点 |
|---|---|---|
| ① | 取约80 mL无酶无菌水于烧杯中 | 使用DEPC处理水或商品化无酶水 |
| ② | 加入Tris-HCl母液和EDTA母液，混匀 | — |
| ③ | 加入海藻糖和PEG8000，搅拌至完全溶解 | 海藻糖溶解较慢，需耐心搅拌 |
| ④ | 缓慢加入Triton X-100，持续搅拌至均匀 | Triton粘稠，移取时注意准确 |
| ⑤ | 最后加入NaOH，搅拌均匀 | ⚠️ 碱性剂最后加，避免提前反应 |
| ⑥ | 加无酶无菌水定容至100 mL，充分混匀 | — |
| ⑦ | 0.22 μm滤膜过滤除菌 | 若在超净工作台内使用无菌原料和无菌器具操作，可省略过滤步骤（仅适用于即时使用或短期保存） |
| ⑧ | 分装至无菌离心管中（如1 mL/管），室温或4℃保存 | — |
Tris-HCl pH确认说明
使用Tris-HCl成品粉末配制时，溶解后pH通常在目标范围内（7.5-8.5）。建议用pH计确认，如有偏差可用稀HCl或NaOH微调——不同品牌和批次的Tris-HCl粉末溶解后pH可能存在差异。
四、操作关键点
4.1 样本处理流程
| 步骤 | 操作 | 说明 |
|---|---|---|
| ① | 将样本（拭子、体液、粪便等）加入释放剂中 | 确保样本完全浸没 |
| ② | 室温静置5-10分钟 | 裂解时间 |
| ③ | 振荡混匀，短暂离心 | 使液体集中于管底 |
| ④ | 取上清液直接作为PCR模板 | 无需纯化 |
4.2 加入体积控制与PCR兼容性
不同配方的PCR兼容性差异较大。首次使用时建议做梯度稀释测试：
| 控制点 | 建议 | 说明 |
|---|---|---|
| 裂解液体积占比 | 建议≤PCR反应体积的1/10 | 对50 μL体系，裂解液≤5 μL |
| 兼容性测试 | 做梯度稀释测试 | 测试裂解液占反应体系1%、5%、10%、20%的扩增效果 |
| SDS体系特别提醒 | 稀释5-10倍后再扩增 | SDS对PCR抑制强烈 |
注：部分商品化释放剂经过特殊配方优化，裂解液可占PCR反应体积的50%而不抑制扩增。自配溶液需自行验证兼容性。
4.3 保存与有效期
| 保存方式 | 有效期 | 说明 |
|---|---|---|
| 自配溶液（4℃） | 建议1周内用完 | 不含长效稳定剂 |
| 自配溶液（-20℃分装） | 可延长至1-3个月 | 避免反复冻融 |
| 商品化产品（2-8℃） | 12个月 | 含稳定剂配方，以产品标签为准 |
五、什么时候用释放剂，什么时候用提取试剂盒？
| 场景 | 推荐方案 | 理由 |
|---|---|---|
| 大批量筛查 | ✅ 释放剂 | 速度快（5-10 min/批） |
| 快速诊断 | ✅ 释放剂 | 操作简单，适合现场 |
| RNA病毒检测 | ✅ 释放剂（含RNA酶抑制剂） | 快速释放，减少降解风险 |
| 低拷贝数检测 | ⚠️ 释放剂（需验证灵敏度） | 释放剂灵敏度可能低于提取法 |
| 精确定量（qPCR标准曲线） | 提取试剂盒 | 纯度要求高 |
| 测序/文库构建 | 提取试剂盒 | 需高纯度核酸 |
| 长期保存核酸 | 提取试剂盒 | 释放剂中核酸稳定性有限 |
六、商业化即用型产品
官网链接：免提取核酸释放剂 一步式释放核酸 省去繁琐提取纯化步骤 保护核酸完整不降解 兼容多种样本与各类扩增实验-杭州富沃克生物科技有限公司
邮箱：support@fwkbio.com
厂家联系微信号：19850855600
参考文献
[1] 湖南圣湘生物科技有限公司. 核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR扩增试剂盒: CN109402240A[P]. 2019-03-01. —— 用于释放剂基础配方（Tris-HCl、NaCl、KCl、Tween-20、Triton X-100、强碱）及各组分浓度范围。
[2] 闫亚平, 张鑫. 一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法: CN112522370A[P]. 2021-03-19. —— 用于免提取试剂配方（海藻糖、PEG8000、Tris-HCl、EDTA、Triton X-100）及各组分
[3] 一种拭子样本核酸释放剂[P]. 上海北昂医药, 2024. —— 用于室温静置5-10分钟即可直接用于PCR实验。
[4] 一种拭子样本核酸释放剂[P]. —— 用于释放剂含强碱、SDS、酶保护剂和曲拉通100。
[5] 拭子核酸样本释放剂及其应用: CN112176029A[P]. 2020. —— 用于表面活性剂浓度范围0.2%-10%（v/v）、缓冲液5-80mM。
[6] 九种核酸提取裂解剂对PCR扩增效率影响研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2023, 35(6). —— 用于不同裂解剂对PCR扩增的抑制效应。
[7] 免提取核酸释放剂产品说明[EB/OL]. 杭州富沃克生物, 2026. —— 用于产品特性（2-10分钟完成释放、兼容多种样本、2-8℃保存）。
[8] 呼吸道病毒核酸快速检测方案的建立与应用[J]. 生物工程学报, 2023, 39(9). —— 用于免提取释放剂在呼吸道病毒检测中的应用。
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