40%（W/V）丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（19:1）配制指南（1 L）

概述

40%（W/V）丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液是DNA PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和小分子蛋白分离的核心储备液。与常规SDS-PAGE（29:1交联度）不同，19:1交联度（丙烯酰胺:BIS）产生的凝胶孔径更小、更致密，特别适合小片段核酸（<1 kb）的高分辨率分离以及小分子量蛋白（<10 kDa）的Tricine-SDS-PAGE。

19:1交联度的优势：

形成更致密的三维网状结构，对小片段核酸具有更强的分子筛效应
适用于DNA测序胶、SSR/AFLP标记检测、miRNA分析等需要高分辨率分离的应用
在小分子蛋白分离中提供更好的分辨率和条带清晰度

丙烯酰胺单体为强神经毒物，配制全过程须严格执行安全规范。本品为1 L规格储备液，配制后于4 ℃避光保存。

19:1 vs 29:1：交联度选择

比较项	19:1（本方案）	29:1（标准方案）
BIS比例	5%（占单体总量的5%）	3.33%（占单体总量的3.33%）
凝胶孔径	更小、更致密	较大、较疏松
分辨率（小分子）	更优	一般
分辨率（大分子）	一般	更优
推荐应用	DNA PAGE、小RNA、小分子蛋白（<10 kDa）	常规SDS-PAGE蛋白（10～200 kDa）

💡 选择建议：若您的实验对象是核酸（尤其<500 bp的DNA/RNA）或<10 kDa的多肽/小蛋白，建议使用19:1（本方案）。常规蛋白电泳选择29:1即可。

所需材料

材料	规格	用量
丙烯酰胺（Acrylamide）	电泳级（≥99.9%）	380 g
甲叉双丙烯酰胺（BIS）	电泳级	20 g
去离子水	超纯水	定容至1 L
0.45 μm滤器	低蛋白结合材质	1个

详细操作流程

第一步：安全防护准备

开启通风橱，确认通风正常
穿戴双层耐化学品手套、护目镜、实验服
称量时佩戴防尘口罩

第二步：称量与混合（通风橱内）
称取380 g 丙烯酰胺和20 g BIS，转移至1 L烧杯中。操作轻缓，避免扬尘。

第三步：加水溶解
加入约600 mL去离子水，使用磁力搅拌器室温搅拌至完全溶解（溶液无色透明，约需30～60分钟）。不可加热。

第四步：定容
用去离子水定容至1 L，充分混匀。

第五步：过滤
使用0.45 μm滤器过滤，去除不溶性杂质。

第六步：pH检测（可选）
pH应在5.0～6.5之间，偏离此范围可能影响聚合效率。

第七步：避光保存
转移至棕色玻璃瓶中（或铝箔包裹透明瓶），标注“⚠️ 40%丙烯酰胺（19:1）神经毒物”及配制日期，于4 ℃避光保存。

DNA PAGE凝胶配制快速参考

以配制10 mL DNA PAGE凝胶为例：

凝胶浓度	40%丙烯酰胺（19:1）	5×TBE	去离子水	10% APS	TEMED
6%	1.5 mL	2.0 mL	6.3 mL	100 μL	10 μL
8%	2.0 mL	2.0 mL	5.8 mL	100 μL	10 μL
10%	2.5 mL	2.0 mL	5.3 mL	100 μL	10 μL
12%	3.0 mL	2.0 mL	4.8 mL	100 μL	10 μL

操作：混匀后立即灌胶，插入梳子，待凝固后使用。

常见问题与解决方案

问题	原因	解决方法
丙烯酰胺溶解缓慢	室温较低	室温搅拌至完全溶解，不可加热
溶液颜色发黄	丙烯酰胺降解	废弃重配，更换新原料
过滤后仍有颗粒	未充分溶解或杂质	延长搅拌时间确保完全溶解
凝胶聚合过快或过慢	pH偏离或APS/TEMED失效	检查原料质量，pH应在5.0～6.5
电泳条带模糊/弥散	交联度选择不当或凝胶不均	确认使用19:1方案，检查灌胶操作
保存后出现结晶	温度过低（近冰点）	若结晶则废弃（不可加热复溶），确认4℃保存

关键操作要点

安全防护不妥协：丙烯酰胺神经毒性具有积累性，手套、护目镜、通风橱三者缺一不可。
不可加热助溶：丙烯酰胺高温水解为丙烯酸，室温搅拌即可。
不可高压灭菌：高温导致聚合，严禁高压灭菌。
不可冷冻保存：冷冻导致结晶析出，不可冷冻。
避光是必须：见光分解，棕色瓶是强制要求。
有效期管理：4 ℃避光保存，有效期约1～3个月。出现颜色变化或pH异常应立即废弃。

应用场景

应用	说明
DNA PAGE	小片段DNA/寡核苷酸高分辨率分离（核心应用）
核酸PAGE	SSR/AFLP标记检测、DNA测序凝胶
RNA PAGE	miRNA、siRNA等小RNA分析
Tricine-SDS-PAGE	小分子量蛋白（<10 kDa）分离