6×Loading Buffer 配制指南（500 mL，pH 7.0）
概述
6×Loading Buffer（6倍浓缩核酸上样缓冲液）是核酸凝胶电泳实验中不可或缺的辅助试剂。它在电泳上样中承担三项核心功能：
增加样品密度：甘油使样品比重增大，确保样品顺利沉入凝胶上样孔底部，防止样品漂浮或扩散。
指示电泳进程：溴酚蓝和二甲苯青FF两种示踪染料随电泳迁移，通过观察染料位置即可估算核酸片段的迁移情况，无需对凝胶进行染色即可判断电泳是否完成。
保护核酸样品：EDTA螯合金属离子，抑制核酸酶活性，防止样品在电泳过程中降解。
本品为500 mL规格的6倍浓缩液，使用时只需与样品按1:5比例混合即可。两种示踪染料分别对应不同大小的DNA片段迁移速率，方便实验者在电泳过程中实时监控分离效果。
所需材料
| 材料 | 规格 | 用量 |
|---|---|---|
| Na₂EDTA·2H₂O | 分析纯 | 4.4 g |
| 甘油（Glycerol） | 分析纯 | 180 mL |
| 溴酚蓝（Bromophenol Blue） | 分析纯 | 250 mg |
| 二甲苯青FF（Xylene Cyanol FF） | 分析纯 | 250 mg |
| 2N NaOH | — | 适量（调pH） |
| 去离子水 | — | 定容至500 mL |
详细操作流程
第一步：称量与初溶
准确称取4.4 g Na₂EDTA·2H₂O、250 mg 溴酚蓝、250 mg 二甲苯青FF，置于500 mL烧杯中，加入约200 mL去离子水。
第二步：加热溶解
将烧杯置于加热磁力搅拌器上，加热并搅拌，直至所有试剂充分溶解（溴酚蓝和二甲苯青FF完全溶解后溶液呈深蓝色/蓝紫色）。若EDTA溶解较慢，可加热至60～70 ℃助溶。
第三步：加入甘油
加入180 mL甘油，继续搅拌均匀。
第四步：pH调节
使用2N NaOH调节溶液pH至7.0。
第五步：定容
用去离子水定容至500 mL，充分混匀。
第六步：保存
转移至试剂瓶中，室温密封保存。
染料迁移速率参照
不同缓冲体系中，两种示踪染料对应的DNA片段大小不同，可根据实验需要选择合适的染料指示：
在1×TAE缓冲液中：
| 染料 | 对应DNA大小（bp） |
|---|---|
| 溴酚蓝（Bromophenol Blue） | ~300 bp |
| 二甲苯青FF（Xylene Cyanol FF） | ~4,000 bp |
在1×TBE缓冲液中：
| 染料 | 对应DNA大小（bp） |
|---|---|
| 溴酚蓝（Bromophenol Blue） | ~200 bp |
| 二甲苯青FF（Xylene Cyanol FF） | ~2,000 bp |
💡 电泳判断技巧：
当溴酚蓝迁移至凝胶约2/3处时，可停止电泳观察小片段（<300 bp）的分离情况。
当二甲苯青FF迁移至凝胶约2/3处时，可停止电泳观察中大片段的分离情况。
若目标片段大于二甲苯青FF的对应大小，需延长电泳时间使染料跑出凝胶前沿。
在甲醛变性RNA电泳（1×MOPS缓冲液）中：
| 染料 | 对应RNA大小（nt） |
|---|---|
| 溴酚蓝（Bromophenol Blue） | ~300 nt |
| 二甲苯青FF（Xylene Cyanol FF） | ~1,000 nt |
💡 RNA电泳判断技巧：若目标RNA片段较大（如mRNA），需让二甲苯青FF跑至凝胶前沿附近方可停止。
配制问题与解决方案
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 溴酚蓝/二甲苯青难溶解 | 染料粉末在水中的溶解速度较慢 | 加热搅拌，或先用少量乙醇溶解染料后再加入 |
| 溶液pH测值偏离7.0 | 各组分酸碱度影响 | 使用2N NaOH仔细调节至目标pH |
| 甘油加入后溶液变浑浊 | 甘油粘稠，局部浓度不均 | 继续充分搅拌，混匀后恢复澄清 |
| 长期保存后出现结晶 | 甘油或蔗糖在低温下析出 | 37 ℃水浴加热溶解后即可正常使用 |
使用说明
6×Loading Buffer为浓缩液，使用时须稀释6倍：
| 样品体积 | 6×Loading Buffer用量 | 最终上样体积 |
|---|---|---|
| 5 μL | 1 μL | 6 μL |
| 10 μL | 2 μL | 12 μL |
| 25 μL | 5 μL | 30 μL |
📌 操作流程：
按上表比例取样品与6×Loading Buffer，用移液器反复吹打或轻微涡旋混匀。
混匀后的样品直接上样至凝胶样品孔中。
6×配方中含有甘油，样品密度足够大，无需额外添加沉底剂。
关键操作要点
染料完全溶解是关键：溴酚蓝和二甲苯青FF为有机染料，在纯水中溶解较慢，配制时建议加热至60～70 ℃并搅拌直至完全溶解，无可见颗粒后方可进行下一步。
甘油助溶：甘油粘度高，建议在染料完全溶解后再加入甘油，便于后续混匀。甘油除增加样品密度外，还能减少样品在电泳过程中的对流扩散。
pH精确控制：pH值影响染料的迁移行为，建议使用pH计精确控制在7.0。
室温保存即可：本品含高浓度甘油，4 ℃保存会增加粘度，不便于移取；若低温保存出现结晶，37 ℃水浴加热复溶即可。
长期使用注意：若溶液颜色明显变浅或出现沉淀，可能是染料降解或EDTA失效，建议重新配制。
应用场景
| 应用 | 说明 |
|---|---|
| 琼脂糖凝胶DNA电泳 | 常规DNA样品上样，示踪电泳进程，常用TAE缓冲液体系 |
| 琼脂糖凝胶RNA电泳 | RNA样品上样（器具及试剂须无RNase），常用TAE或MOPS缓冲液体系 |
| PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 小片段DNA/RNA分离，染料迁移参照溴酚蓝~200 bp（TBE） |
| PCR产物电泳鉴定 | 通用上样缓冲液，配合TAE适用于大多数PCR产物 |
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