10×Loading Buffer 配制指南（10 mL）——RNA电泳专用

概述

10×Loading Buffer是RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳中专门用于RNA样品上样的缓冲液。与常规DNA上样缓冲液（6×Loading Buffer）不同，本品具有三大RNA电泳适配特点：

• 高浓度染料（0.25%） ：确保在RNA甲醛变性胶（含甲醛，背景荧光高）中清晰可见，便于实时追踪电泳进程。

• 高浓度甘油（50%） ：确保RNA样品在低电压、长时间电泳过程中稳定沉于上样孔底。

• 严格无RNase：全程使用DEPC处理水和无RNase耗材配制，杜绝RNase污染导致的RNA降解。

本品为10 mL规格的10倍浓缩液，配制量较小，适合RNA电泳对洁净度和新鲜度的高要求。RNA对RNase极为敏感，因此本品的配制用水、储备液及所有接触耗材均须满足无RNase标准。

为什么RNA电泳上样缓冲液的染料浓度更高？

所需材料

详细操作流程

第一步：准备无RNase环境
将所有使用的器具（离心管、枪头、移液器、称量勺）确认或处理为无RNase级。操作台面清洁，佩戴手套操作。

第二步：加入EDTA和染料
取一支10 mL无RNase离心管，加入200 μL 0.5M EDTA（pH 8.0）（DEPC处理） ，再称取25 mg 溴酚蓝和25 mg 二甲苯青FF加入离心管中。

第三步：初溶
加入约4 mL DEPC处理水，盖紧管盖，涡旋振荡或使用移液器反复吹打，至染料完全溶解（溶液呈深蓝紫色，无可见颗粒）。

第四步：加入甘油
加入5 mL甘油，盖紧管盖后充分混匀（甘油粘稠，需较长时间混匀）。

第五步：定容
用DEPC处理水定容至10 mL，充分颠倒混匀。

第六步：保存
室温密封保存，避免反复开盖。

使用说明

10×Loading Buffer为浓缩液，使用时须根据实验需要稀释至合适倍数，使最终上样体系中染料浓度适宜观察。

📌 操作流程：

1. 取适量RNA样品，按9:1或适当比例与10×Loading Buffer混合（确保染料终浓度落在可观察范围内）。

2. 样品与缓冲液混匀后，于65～70 ℃加热变性3～5分钟，迅速冰浴冷却，然后上样至甲醛琼脂糖凝胶中。

3. 上样后立即开始电泳，观察染料迁移位置判断电泳进程。

常见问题与解决方案

染料迁移速率参照（RNA甲醛变性胶，1×MOPS）

💡 电泳判断技巧：

• 观察溴酚蓝可判断小片段RNA（如tRNA、5S rRNA）的迁移情况。

• 观察二甲苯青FF可判断mRNA等较大RNA片段的迁移位置。

• 当二甲苯青FF接近凝胶前沿时，可停止电泳观察大片段RNA的分离。

关键操作要点

1. DEPC水是硬性要求：RNA电泳上样缓冲液的配制用水必须使用DEPC处理水，普通去离子水中可能含RNase活性。

2. 所有耗材无RNase：使用的离心管、枪头、移液器、称量勺等均须为无RNase级，或经DEPC处理/高温烘烤后使用。

3. 操作过程戴手套：操作者皮肤和唾液中含RNase，配制全过程必须佩戴手套。

4. 避免反复开盖：配制完成后建议分装成小份（如200 μL/管），避免每次取用时反复开盖引入RNase污染。

5. 室温保存即可：本品含高浓度甘油，4 ℃保存会增加粘度，不便于移取。

应用场景