10×PBST 缓冲液配制指南（1 L，pH 7.4）

概述

10×PBST（磷酸盐缓冲液-吐温20，Phosphate Buffered Saline with Tween-20）是免疫学实验中最基础的洗涤缓冲液储备液，广泛应用于ELISA、Western Blot、免疫组化（IHC）等实验中。吐温-20（Tween-20）是一种非离子型表面活性剂，其核心功能是减少非特异性结合——降低抗体、蛋白质与固相载体（如ELISA板、NC膜、PVDF膜）的非特异性吸附，显著降低背景信号。

各组分功能：

组分	浓度（1×工作液）	核心功能
NaCl	137 mM	维持生理离子强度，提供渗透压
KCl	2.7 mM	补充钾离子，维持离子平衡
Na₂HPO₄	10 mM	磷酸氢根离子，与KH₂PO₄构成缓冲对
KH₂PO₄	2 mM	磷酸二氢根离子，与Na₂HPO₄构成缓冲对
Tween-20	0.1%	非离子表面活性剂，减少非特异性结合

本品为10倍浓缩液，使用时稀释至1×工作液。Tween-20在母液（10×）中浓度较高（1%），稀释后为0.1%的工作浓度，是ELISA/Western Blot洗涤缓冲液的标准配比。

所需材料

材料	规格	用量
NaCl（氯化钠）	分析纯	80 g
KCl（氯化钾）	分析纯	2 g
Na₂HPO₄（磷酸氢二钠，无水）	分析纯	14.4 g
或 Na₂HPO₄·12H₂O	分析纯	29 g
KH₂PO₄（磷酸二氢钾）	分析纯	2.4 g
Tween-20	分子生物学级	10 mL
去离子水	超纯水	定容至1 L

详细操作流程

第一步：称量盐类
称取80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na₂HPO₄（或29 g Na₂HPO₄·12H₂O）、2.4 g KH₂PO₄，置于1 L烧杯中。

第二步：溶解盐类
加入约800 mL去离子水，使用磁力搅拌器充分搅拌至所有盐类完全溶解（溶液应清澈透明，无可见颗粒）。

第三步：加入吐温-20
加入10 mL Tween-20。由于Tween-20为粘稠液体，需持续搅拌至完全分散（约10～15分钟）。建议将Tween-20预先与少量去离子水混合后加入，避免局部浓度过高。

第四步：pH调节
使用浓盐酸（pH偏高时）或10 M NaOH（pH偏低时），将pH精确调至7.4。必须在室温下测定pH，PBST缓冲液具有与Tris类似的温度依赖性，但程度较轻。

第五步：定容
用去离子水定容至1 L，充分混匀。

第六步：灭菌与保存
转移至试剂瓶中，高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）。灭菌后冷却，室温密封保存。

Tween-20的作用机制

Tween-20（聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯，Polysorbate 20）是一种非离子型表面活性剂，在免疫学实验中有两个核心功能：

功能	机制
① 减少非特异性结合	吐温-20分子包裹疏水表面（如ELISA板孔壁、膜表面），阻断抗体/蛋白质与固相载体的非特异性疏水吸附
② 洗涤去除未结合物	洗涤过程中，吐温-20破坏弱非特异性相互作用，将未结合的抗体、蛋白质等从固相表面“洗脱”

💡 无吐温-20（PBS）：仅有缓冲和离子维持功能，非特异性结合高，背景信号强。
✅ 含吐温-20（PBST）：加入0.1%吐温-20后，非特异性结合显著降低，背景干净。

常见问题与解决方案

问题	原因	解决方法
Tween-20加入后呈油滴状悬浮	搅拌不充分	继续充分搅拌至完全分散；可先与少量水预混再倒入
灭菌后溶液出现浑浊或絮状物	微生物污染或Tween-20聚集	废弃重配，检查配制容器的洁净度和灭菌条件
ELISA/Western背景高	PBST中Tween-20浓度不足（<0.1%）	检查稀释比例是否正确（10× → 1×稀释10倍）
信号强度低于预期	Tween-20浓度过高（>0.2%）	过高浓度吐温会洗脱特异性结合的抗体/蛋白；重新确认稀释比例
pH灭菌后变化	高温高压影响磷酸盐体系	灭菌冷却后，若pH偏离7.4±0.1，可用稀NaOH或HCl微调（需无菌操作）
配制后盐类溶解不完全	水温过低或搅拌不足	室温充分搅拌，可适当加热（<50 ℃）助溶

关键操作要点

Tween-20需充分混匀：Tween-20为粘稠液体，加入后若搅拌不足会以油滴状态悬浮在溶液中，导致稀释后工作液中浓度不均匀、实验重复性差。建议磁力搅拌至少10～15分钟至溶液完全清澈透明。
pH室温下精确调节：PBST缓冲液的pH影响抗体-抗原结合效率，必须在室温（约25 ℃）下使用pH计精确调至7.4，不可使用pH试纸。
磷酸盐形态选择：Na₂HPO₄有无水物（分子量142）和十二水合物（分子量358）两种。称量前务必核对试剂标签，无水物用14.4 g，十二水合物用29 g，两者不可互换用量。
灭菌方式：PBST可高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）。灭菌后的母液在室温下可稳定保存数月，若出现浑浊或污染需重新配制。
工作液有效期：稀释后的1×PBST工作液建议现配现用，室温放置不宜超过1周（Tween-20可能降解或滋生微生物）。
吐温-20浓度校准：若实验背景持续偏高或偏低，检查Tween-20的添加量——10×母液中1%对应1×工作液中0.1%，为免疫学实验的标准浓度。

应用场景

应用	使用方式	典型浓度
ELISA	孔板洗涤缓冲液	1×PBST（0.1% Tween-20）
Western Blot	膜洗涤缓冲液	1×PBST（0.1% Tween-20）
抗体稀释液	与BSA/脱脂奶粉配合使用	1×PBST + 1～5% BSA/脱脂奶粉
免疫组化（IHC）	组织切片洗涤液	1×PBST（0.1% Tween-20