PAGE 凝胶配制指南

概述

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是分子生物学中高分辨率核酸和蛋白质分离的核心技术。其分辨率远高于琼脂糖凝胶，可分离仅差1～2 bp的核酸片段（测序胶）或仅差1～2 kDa的蛋白质。本方案基于不连续缓冲体系（TBE缓冲液），适用于DNA测序、SSR/AFLP分子标记、小片段核酸分析、蛋白质SDS-PAGE等实验。

PAGE凝胶的核心组分：

组分	功能	关键特性
30% Acrylamide（29:1）	凝胶骨架（单体）	29:1为DNA PAGE标准交联度，孔径致密
5×TBE	缓冲体系	Tris-硼酸-EDTA，提供离子环境和pH稳定性
10% APS	聚合催化剂	提供自由基，现配现用（4℃≤1周）
TEMED	聚合加速剂	催化APS分解产生自由基，临用前加入

胶浓度选择指南

DNA PAGE最佳分离范围

凝胶浓度	最佳DNA分离范围（bp）	推荐应用
3.5%	1,000～10,000+	大片段DNA分析、脉冲场PAGE
5%	500～10,000	大片段DNA分析
8%	100～2,000	DNA测序胶、SSR/AFLP检测
12%	50～800	小片段DNA/寡核苷酸分析
20%	10～200	miRNA、引物分析、小RNA

SDS-PAGE蛋白分离范围（参考）

凝胶浓度	最佳蛋白分离范围（kDa）
5%	100～300
8%	40～200
10%	20～120
12%	14～100
15%	10～60
20%	<30

所需材料

材料	规格	用途
30% Acrylamide/BIS（29:1）	电泳级，4℃避光	凝胶骨架
5×TBE缓冲液	无菌	缓冲体系
10% APS（过硫酸铵）	现配现用或4℃≤1周	聚合催化剂
TEMED	4℃避光保存	聚合加速剂
去离子水	超纯水	稀释

详细操作流程

第一步：配制30% Acrylamide/5×TBE贮存混合液（可预存）

按目标胶浓度对应的配方表，量取去离子水、30% Acrylamide（29:1）、5×TBE于洁净烧杯中。
低速磁力搅拌或轻轻颠倒混匀（避免气泡产生）。
转移至棕色瓶中，4 ℃避光保存（此混合液不含APS/TEMED，可稳定保存1～2周）。

第二步：临用前加入引发剂

取所需体积的贮存混合液，加入10% APS，快速混匀。
临灌胶前加入TEMED，立即轻轻颠倒混匀。
用移液管或注射器缓慢注入电泳胶板间隙（避免产生气泡）。

⚠️ 聚合反应启动：TEMED加入后聚合反应即刻启动，需快速操作（2～3分钟内完成灌胶）。

第三步：插梳与聚合

垂直插入梳子（避免产生气泡）。
室温（25 ℃）静置30～60 min至完全聚合。

第四步：拔梳与预电泳

聚合完成后小心拔梳（垂直缓慢拔出，防止撕裂胶孔）。
用1×TBE缓冲液冲洗加样孔，去除未聚合的丙烯酰胺残留。
安装电泳槽，加入1×TBE运行缓冲液，预电泳10～15分钟后上样。

常见问题与解决方案

问题	原因	解决方法
凝胶不聚合（长时间仍为液体）	APS或TEMED失效	更换新鲜APS（现配现用）；检查TEMED是否挥发
凝胶聚合过快（＜10分钟凝固）	室温过高或APS/TEMED过量	减少APS/TEMED用量（尤其室温＞30℃时）
凝胶聚合过慢（＞2小时）	室温过低或APS/TEMED不足	增加APS/TEMED用量；室温＜20℃时适当增加
凝胶出现气泡	灌胶时混入气泡或搅拌过猛	灌胶时沿胶板壁缓慢注入；用枪头挑破气泡
凝胶开裂或收缩	聚合过快或凝胶过厚	减少APS/TEMED用量；控制室温
加样孔不平整	拔梳过快或凝胶未完全聚合	拔梳垂直缓慢拔出；确保完全聚合后再拔
电泳条带模糊（微笑效应）	胶板受热不均或缓冲液浓度不当	控制电泳电压；使用新鲜1×TBE工作液
上样时样品溢出加样孔	加样孔内有未聚合残留物	用1×TBE彻底冲洗加样孔后再上样

关键操作要点

⚠️ 丙烯酰胺神经毒性防护：丙烯酰胺为神经毒性物质，操作全程戴手套、口罩、护目镜，避免皮肤接触或吸入粉尘。聚合后毒性虽大幅降低，仍建议规范操作。
⚠️ 10% APS现配现用：APS溶液在室温下快速水解失效，建议现配现用（4℃保存≤1周）。若凝胶聚合失败，首先怀疑APS失效。
⚠️ TEMED保存：TEMED易挥发，开封后密封4℃避光保存，用后立即旋紧瓶盖。
⚠️ 温度调控：聚合速度对温度敏感。室温＜20℃可适当增加APS/TEMED用量10～20%；室温＞30℃减少用量10～20%，防止聚合过快导致凝胶开裂或聚合不完全。
⚠️ 灌胶操作：灌胶时缓慢注入，避免产生气泡。若有气泡，用枪头或细针头挑破。
⚠️ 5×TBE稀释：电泳运行缓冲液和冲洗加样孔均使用1×TBE工作液（5×TBE稀释5倍），不可直接使用5×TBE。

应用场景

应用	推荐胶浓度	缓冲液
DNA测序（Sanger法）	8%	1×TBE
SSR/AFLP分子标记检测	8%–12%	1×TBE
小片段DNA/寡核苷酸分离	12%–20%	1×TBE
miRNA分析	15%–20%	1×TBE
常规SDS-PAGE蛋白电泳	8%–15%（依蛋白大小）	Tris-Glycine
大片段DNA分析（＞10 kb）	3.5%–5%	1×TBE