SDS-PAGE 浓缩胶与分离胶配制指南
概述
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是基于Laemmli不连续缓冲体系的蛋白质电泳技术，包含浓缩胶（stacking gel）和分离胶（resolving gel）两层结构。蛋白质样品在浓缩胶中被压缩成薄层后进入分离胶，依分子量大小实现高分辨率分离。
不连续缓冲体系的核心原理：
| 凝胶层 | pH | Tris浓度 | 核心功能 |
|---|---|---|---|
| 浓缩胶（5%） | 6.8 | 0.125 M | 将蛋白质样品压缩成薄层，所有蛋白在进入分离胶前集中在同一起跑线 |
| 分离胶（6%–15%） | 8.8 | 0.375 M | 按分子量大小分离蛋白质（小分子跑得快，大分子跑得慢） |
💡 SDS的作用：SDS使蛋白质变性并包裹负电荷，使所有蛋白质的电荷/质量比趋于一致，分离仅取决于分子量大小。
配制流程
所需材料
| 材料 | 规格 | 用途 |
|---|---|---|
| 超纯水 | 电泳级 | 溶剂 |
| 30% Acrylamide（29:1） | 电泳级，4℃避光 | 凝胶骨架 |
| 1.0 M Tris-HCl（pH 6.8） | 无菌 | 浓缩胶缓冲液 |
| 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8） | 无菌 | 分离胶缓冲液 |
| 10% SDS | 电泳级 | 蛋白变性剂 |
| 10% APS | 现配现用 | 聚合催化剂 |
| TEMED | 4℃避光 | 聚合加速剂 |
分离胶配制步骤
选择胶浓度：根据目标蛋白分子量选择6%、8%、10%、12%或15%。
计算用量：根据凝胶厚度和胶板尺寸确定所需体积（常规Mini-PROTEAN系统约需5～10 mL/块）。
混合组分：按配方表量取超纯水、30% Acrylamide、1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）和10% SDS于烧杯中。
脱气：抽真空或超声脱气2～3分钟（去除溶解氧，避免聚合抑制）。
加入APS与TEMED：按配方表加入10% APS和TEMED，快速混匀。
灌胶：将混合液沿胶板壁缓慢注入胶板间隙至标记线（约3/4高度）。
液封：立即用去离子水或异丙醇覆盖胶面（隔绝氧气，使胶面平整）。
聚合：室温静置30～60分钟。
浓缩胶配制步骤
倾去液封：分离胶完全凝固后，倒掉上层水/异丙醇，用滤纸吸干残留液。
混合组分：按配方表量取超纯水、30% Acrylamide、1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）和10% SDS。
加入APS与TEMED：按配方表加入10% APS和TEMED，快速混匀。
灌胶：将混合液注入分离胶上层至胶板顶部。
插梳：垂直插入梳子（避免气泡），室温静置30～60分钟。
拔梳：聚合完成后小心拔梳，用1×电泳缓冲液冲洗加样孔。
分离胶浓度选择指南
| 凝胶浓度 | 最佳分离范围（kDa） | 典型应用 |
|---|---|---|
| 6% | 50～200 | 肌球蛋白（200 kDa）、β-半乳糖苷酶（116 kDa） |
| 8% | 30～150 | 常规中高分子量蛋白分析 |
| 10% | 20～120 | 最常用：多数常规蛋白（如BSA 66 kDa、Actin 42 kDa） |
| 12% | 10～60 | 小分子量蛋白分析 |
| 15% | 5～40 | 小分子多肽、低丰度蛋白 |
常见问题与解决方案
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 凝胶不聚合 | APS或TEMED失效 | 更换新鲜APS（现配现用）；检查TEMED是否挥发 |
| 聚合过快（＜10 min） | 室温过高或APS/TEMED过量 | 减少APS/TEMED用量；室温＞30℃时建议减少 |
| 聚合过慢（＞2 h） | 室温过低或APS/TEMED不足 | 增加APS/TEMED用量；室温＜20℃时建议增加 |
| 胶面不平整 | 液封时引入气泡或分离胶未完全凝固 | 确保完全凝固后再加浓缩胶；沿胶板壁缓慢覆盖水/异丙醇 |
| 凝胶出现气泡 | 灌胶时混入气泡或搅拌过猛 | 灌胶时沿胶板壁缓慢注入；用枪头挑破气泡 |
| 加样孔不平整 | 拔梳过快或凝胶未完全聚合 | 垂直缓慢拔梳；确保完全聚合后再拔 |
| 蛋白条带“微笑” | 电泳槽受热不均或缓冲液浓度不当 | 控制电压（恒压≤200 V）；使用新鲜1×电泳缓冲液 |
| 小分子蛋白条带模糊（弥散） | 分离胶浓度过低（如用10%分离<20 kDa蛋白） | 改用12%或15%分离胶 |
| 凝胶开裂 | 聚合过快或干燥过度 | 减少APS/TEMED；用保鲜膜包裹防干燥 |
关键操作要点
⚠️ 丙烯酰胺神经毒性防护：操作全程戴手套、口罩、护目镜，避免皮肤接触或吸入粉尘。
⚠️ 10% APS现配现用：APS在室温下快速水解失效，建议现配现用（4℃保存≤1周）。
⚠️ TEMED保存：TEMED易挥发，开封后密封4℃避光保存。
⚠️ 温度调控：室温＜20℃时适当增加APS/TEMED用量；＞30℃时减少用量，防止聚合过快开裂。
⚠️ 先灌分离胶再灌浓缩胶：不可同时灌制。分离胶完全聚合（30～60 min）后才可灌浓缩胶。
⚠️ 液封：分离胶灌完后必须用去离子水或异丙醇覆盖胶面，隔绝氧气促进平整聚合。
⚠️ 电泳缓冲液：使用1×Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液（即5×储备液稀释5倍）。
应用场景
| 应用 | 推荐分离胶浓度 |
|---|---|
| 常规SDS-PAGE蛋白分析 | 10%（最通用） |
| Western Blot检测 | 依靶蛋白大小选择8%–12% |
| 小分子多肽分析（＜20 kDa） | 12%–15% |
| 高分子量蛋白分析（＞100 kDa） | 6%–8% |
| 蛋白纯度分析 | 依蛋白大小选择 |
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