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DNase I溶液：从储存液到工作液，配错一步全白做

发布时间：2026-07-25 点击数：1

DNase I溶液：从储存液到工作液，配错一步全白做

做RNA实验最怕什么？提完RNA跑胶一看，28S和18S条带倒是清晰，但基因组DNA的条带也明晃晃地在那里。qPCR内参Ct值异常、反转录效率忽高忽低——所有问题都指向同一个根源：你的RNA样本里混进了基因组DNA。

DNase I处理是解决这个问题的“标准答案”。但DNase I本身的配制，却让不少实验者栽了跟头。买来的干粉不会配、储存液和工作液搞混、反复冻融导致酶活大幅下降——每一步都可能出错。

本文把储存液与工作液的分层逻辑、不同产品形态的配制方案、操作关键点拆透——帮您一次配对，不再翻车。

一、核心参数一览

参数	内容
中文名称	脱氧核糖核酸酶I（DNase I）
英文名称	Deoxyribonuclease I
来源	牛胰腺（最常见）
分子量	~31 kDa
最适pH	~7.0–8.0
活性依赖	二价阳离子（Mg²⁺或Mn²⁺）——无金属离子，无活性
抑制剂	EDTA、EGTA、SDS、金属离子螯合剂
灭活方式	EDTA螯合（终浓度2.5 mM）或65°C加热10分钟

二、储存液 vs 工作液——先搞清楚这两个概念

DNase I的配制分为储存液和工作液两个层级，两者不能混用：

层级	用途	特点
储存液	长期保存	高浓度、含甘油防冻保护、-20°C保存
工作液	上样消化	临用现配、稀释至使用浓度、不含EDTA

核心原则：储存液是“原料”，工作液是“耗材” 。每次消化前需要将储存液稀释成工作液，切勿将工作液重新冻回储存。

三、配制前的关键决策——先看产品形态，再选方案

市面上DNase I产品的形态主要有三种，不同形态的配制逻辑完全不同：

产品形态	常见品牌/来源	你需要做什么
冻干粉	天根（RT411）、Thermo Fisher、Sigma	需溶解配制成储存液，再稀释为工作液
高浓度甘油储存液（已配制好）	GoldBio、NEB部分产品	无需配制储存液，直接取用稀释为工作液
即用型液体（低浓度，无甘油）	部分试剂盒配套	直接使用，无需任何配制

⚠️ 特别提醒：冻干粉有时会形成一层透明薄膜贴在瓶壁上，肉眼看起来像是空的——请不要误以为瓶子是空的而丢弃或打开瓶盖，造成损失。

冻干粉的两种溶解逻辑

如果买到的是冻干粉，溶解时有两种方案可选——水溶法（无甘油）和甘油保护法（含甘油），两者保存期限完全不同：

溶解方案	溶剂	保存温度	有效期	适用场景
水溶法	RNase-Free ddH₂O	-20°C冻存	9个月（-20°C）；6周（4°C）	干粉复溶、短期使用
甘油保护法	含50%甘油的缓冲液	-20°C（不结冰）	长期（避免反复冻融即可）	高浓度酶液长期保存

四、常用储存液配制方案一览

以下是多方来源验证的DNase I储存液配制方案：

方案	储存液溶剂/缓冲液	关键添加剂	参考浓度	保存条件	来源/适用场景
方案一（水溶法）	RNase-Free ddH₂O	无	~2.7 U/μL（1500 U/550 μL）	-20°C 9个月；4°C 6周	天根DNase I干粉（RT411）
方案二（Tris+甘油+Mg²⁺）	20 mM Tris-HCl（pH 7.5）	50%甘油 + 1 mM MgCl₂	≥2 mg/mL	-20°C	Sigma推荐方案
方案三（Tris+甘油+NaCl）	20 mM Tris（pH 7.5）	50%甘油 + 50 mM NaCl	20,000 U/mL	-20°C分装	PMC文献，用于DNase I足迹实验
方案四（Tris+甘油+CaCl₂）	10 mM Tris-HCl（pH 7.6）	50%甘油 + 2 mM CaCl₂	—	-20°C	部分商品化储存方案
方案五（稀HCl+甘油法）	0.0025 N HCl	50%甘油	2 mg/mL	-20°C	CSH Protocols经典配方

⚠️ 关于方案五（稀HCl法）的重要说明

CSH Protocols推荐的稀HCl溶解法是经典方法，稀HCl本身对DNase I活性没有影响。但如果后续要将该储存液用于RNA样品的消化处理，且担心极微量酸残留可能对RNA有潜在影响，可改用10 mM Tris-HCl（pH 7.5）代替0.0025 N HCl进行溶解——两者均可获得活性良好的DNase I储存液。

为什么甘油能保护DNase I？

DNase I在反复冻融过程中容易失活。加入50%（v/v）甘油后，溶液在-20°C不会结冰，可以避免冰晶损伤酶蛋白结构，同时保持酶活性稳定。

五、配制步骤——以天根DNase I干粉（1500 U）为例

步骤	操作	关键要点
1	准备RNase-Free ddH₂O、无菌枪头	所有接触DNase I的耗材必须RNase-Free
2	用RNase-Free注射器吸取550 μL RNase-Free ddH₂O	—
3	将水注入DNase I干粉瓶中	干粉有时会形成透明薄膜贴壁，肉眼看似空瓶——确认有粉，再操作
4	轻柔颠倒混匀至完全溶解	禁止涡旋振荡——DNase I是蛋白质，剧烈振荡会变性失活
5	分装成小份（20–50 μL/管），-20°C冻存	建议按单次使用量分装，避免反复冻融

融化后的储存液怎么处理？

从-20°C取出的DNase I储存液融化后，应置于4°C保存（可保存6周），不要再次冻存。反复冻融是DNase I失活的最常见原因。

六、工作液的配制

工作液临用现配，配制后立即使用，不可保存。

方案A：天根柱式RNA提取方案（以天根试剂盒为例）

每个样品取 10 μL DNase I储存液，加入 70 μL Buffer RDD（天根试剂盒配套的即用型缓冲液），轻柔混匀。

注意：Buffer RDD是天根试剂盒专用缓冲液，非通用试剂。如使用其他品牌试剂盒，请按该品牌说明书配制工作液。

方案B：通用工作液配制逻辑

组分	用量	说明
DNase I储存液	按实验需求	根据目标DNA量和酶活计算
反应缓冲液（含Mg²⁺）	补足至终体积	必须含二价阳离子，不能含EDTA

关键：工作液和反应缓冲液中不能含有EDTA——EDTA会螯合掉Mg²⁺，使DNase I完全失活。

七、五个实验党必看的操作关键点

① 金属离子是“启动开关”

DNase I的活性严格依赖Mg²⁺或Mn²⁺。反应体系中必须含有这些二价阳离子，否则酶“有劲使不出”。

Mg²⁺存在时，DNase I在双链DNA的每条单链上随机产生切口；Mn²⁺存在时，可在同一位点切断DNA双链。

② EDTA是“终止按钮”

要终止DNase I反应，有以下几种方式（按推荐优先级排序）：

优先级	终止方式	适用场景	注意事项
首选	柱式纯化	所有RNA样品	同时去除DNase I和DNA片段，最彻底、最安全
次选	65°C加热10分钟	对热稳定RNA	高温可能导致部分RNA降解
末选	加EDTA至终浓度2.5 mM	后续需保持RNA完整性	EDTA会螯合反转录所需的Mg²⁺，后续需补加Mg²⁺

③ 融化的储存液不要再冻回去

从-20°C取出的储存液融化后，应置于4°C保存（可保存约6周），不要再次冻存
反复冻融是DNase I失活的最常见原因——这也是为什么建议分装成小份后冻存

④ DNase I ≠ RNase-Free DNase I

普通DNase I可能含有RNase污染，用于RNA样品处理时务必选择“RNase-Free”级别的DNase I
不要拿实验室自配的普通DNase I去处理RNA样品

⑤ 用量参考——注意不同厂家的单位定义不同

不同厂家对DNase I活力单位的定义不完全相同：

品牌/来源	1 U 的定义
Sigma	37°C、pH 7.0，10 min完全降解1 μg质粒DNA
Kunitz单位	25°C、pH 7.0，1 min使λDNA的A₂₆₀增加0.001
天根	以产品说明书为准

建议：

一般1 U DNase I可消化<1 μg DNA

不同厂家单位定义不同，更换品牌时务必以新品牌说明书为准

首次使用某品牌产品时，建议做预实验优化用量

八、常见问题速查

问题	原因	解决方案
DNase I处理后有DNA残留	①酶量不足 ②反应时间不够 ③缓冲液含EDTA抑制酶活性	①增加酶量 ②延长消化时间 ③检查缓冲液配方
DNase I处理后RNA降解	使用的DNase I含RNase污染	换用RNase-Free级别DNase I
反复冻融后活性下降	冻融损伤酶蛋白	分装冻存，每管单次用量
储存液融化后又冻回去	操作不当	已融化应置于4°C保存，6周内用完
不知道自己的产品该配成多少浓度	未确认产品形态	看试剂瓶标签——是冻干粉还是甘油溶液？按标签说明操作