1.5 M Tris-HCl 缓冲液配制指南（1 L，pH 8.8）

概述

1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）是SDS-PAGE蛋白电泳分离胶（下层胶）的标准缓冲液，是Laemmli SDS-PAGE体系中不可或缺的核心组分。在分离胶中，pH 8.8的缓冲环境确保蛋白质在电泳过程中维持稳定的负电荷状态，根据分子量大小在凝胶中实现高效分离。

1.5 M Tris-HCl pH 8.8在SDS-PAGE中的核心作用：

Tris的pH值随温度变化显著（每℃变化约0.03单位），配制时必须严格遵守“室温调节pH”的原则。本品为1 L规格储备液，经高温高压灭菌后室温长期保存。

在Laemmli SDS-PAGE系统中，两种Tris-HCl缓冲液配合使用：

💡 两种缓冲液不可互换或混用，pH差异决定了凝胶的功能分区。

第一步：称量与溶解
称取181.7 g Tris碱，置于1 L烧杯中，加入约800 mL去离子水。使用磁力搅拌器搅拌至Tris完全溶解（Tris溶解为放热反应，溶液会升温，属正常现象）。

第二步：冷却至室温
将溶液静置冷却至室温（约25 ℃）。此步骤不可省略——若在热态下调pH，冷却至室温后pH会显著偏低。

第三步：pH调节
在搅拌条件下，缓慢、逐滴加入浓盐酸，使用pH计实时监测。接近pH 8.8时应放慢加酸速度，避免过调。

📌 根据1 M Tris-HCl pH 8.0的经验，调至pH 8.8所需浓盐酸约为30～35 mL（每升），较pH 8.0用量更少。

第四步：定容
pH精确达到8.8后，用去离子水定容至1 L，充分混匀。

第五步：灭菌与保存
转移至耐高温试剂瓶中，高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）。灭菌后冷却，室温密封保存。

Tris-HCl缓冲液的pH具有显著的温度依赖性：

温度每升高1 ℃，Tris-HCl溶液的pH下降约0.03个单位。
温度每降低1 ℃，Tris-HCl溶液的pH上升约0.03个单位。

配制时溶液温度	实测pH（调至8.8）	冷却至25 ℃后的实际pH	是否合格
4 ℃（冰浴）	8.8	<8.0	❌ 严重偏离
室温25 ℃ ✅	8.8	8.8	✅ 准确
37 ℃	8.8	>9.0	❌ 严重偏离

⚠️ 必须在室温（约25 ℃）下调节pH至8.8。若在分离胶灌胶时溶液温度与配制温度不一致，可预先考虑温度漂移——但最规范的做法是始终在室温下操作和调节。

SDS-PAGE分离胶配制快速参考（10 mL体系）

分离胶浓度	去离子水	1.5 M Tris-HCl pH 8.8	30% Acrylamide	10% SDS	10% APS	TEMED
8%	4.3 mL	2.5 mL	2.7 mL	0.1 mL	0.1 mL	6 μL
10%	3.7 mL	2.5 mL	3.3 mL	0.1 mL	0.1 mL	4 μL
12%	3.0 mL	2.5 mL	4.0 mL	0.1 mL	0.1 mL	4 μL
15%	2.0 mL	2.5 mL	5.0 mL	0.1 mL	0.1 mL	4 μL