5×SDS-PAGE 上样缓冲液配制指南（5 mL）

概述

5×SDS-PAGE上样缓冲液是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中蛋白样品前处理的核心试剂。其各组分分工明确，协同确保蛋白质在电泳前得到充分变性和均匀电荷修饰。

各组分功能：

💡 SDS与β-ME协同作用：SDS破坏蛋白质的高级结构（非共价键），β-ME还原断裂二硫键（共价键）。两者缺一不可，共同实现蛋白质的完全变性和亚基解聚。

β-巯基乙醇的使用前加入是延长上样缓冲液保存时间的关键。本品为5倍浓缩液，使用时与蛋白样品按1:4比例混合（最终1×）。2-ME有剧毒和恶臭，配制全过程须在通风橱内严格执行安全操作。

所需材料

详细操作流程

第一步：基础缓冲液配制（不含2-ME）

1. 取一支10 mL塑料离心管，依次加入：

• 1.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8）

• 2.5 mL 甘油

• 0.5 g SDS

• 25 mg 溴酚蓝

2. 加去离子水至约4 mL，盖紧管盖，涡旋振荡或使用移液器反复吹打，至SDS和溴酚蓝完全溶解。

3. 用去离子水定容至5 mL，充分混匀。

4. 小份分装：按单次实验用量分装（推荐500 μL/份），标注“5×SDS Loading Buffer（不含2-ME）”及配制日期。

第二步：使用前加入β-巯基乙醇

取一小份基础缓冲液（500 μL），在通风橱内加入25 μL β-巯基乙醇（2-ME） ，盖紧管盖，充分混匀。此时溶液颜色可能变为蓝绿色或淡黄色。

第三步：样品制备与加热变性

β-巯基乙醇（2-ME）安全操作规范

⚠️ β-巯基乙醇具有剧毒和强烈恶臭，必须严格遵守以下安全规范：

常见问题与解决方案

关键操作要点

1. 2-ME使用前加入是核心原则：β-巯基乙醇为强还原剂，在溶液中逐渐氧化失效。应在新配基础缓冲液的小份分装中按需加入，现配现用，不可预先加入全部储备液中长期保存。

2. 颜色变化不影响使用：加入2-ME后溴酚蓝由深蓝色变为蓝绿色、绿色或黄色，这是溴酚蓝被还原剂还原的正常反应，不影响示踪功能。若颜色完全消失（变无色），则2-ME加入过量，仍可正常使用。

3. 安全第一：2-ME的恶臭和毒性不容忽视，通风橱操作是绝对要求。若实验条件有限无法使用通风橱，可使用无臭还原剂（如TCEP）替代2-ME，但需注意浓度换算。

4. 加热温度和时间：多数蛋白质在95～100 ℃加热5～10分钟即可充分变性。对于易降解或疏水性强的蛋白，可适当降低温度（70 ℃，10分钟）或延长加热时间。

5. SDS与2-ME的协同作用：SDS单独处理仅破坏非共价键，无法断裂二硫键。β-ME是断裂二硫键的关键组分，对于含二硫键的蛋白（如抗体、膜蛋白等）不可省略。

与无还原剂上样缓冲液的区别

应用场景