5×Tris-Glycine Buffer 配制指南（1 L）

——SDS-PAGE电泳运行缓冲液

5×Tris-Glycine Buffer是SDS-PAGE蛋白电泳（Laemmli系统）的运行缓冲液储备液，是Western Blot和蛋白分析实验中最基础的缓冲液之一。在电泳过程中，该缓冲液维持稳定的pH环境，并提供必要的离子强度，确保蛋白质按照分子量大小在凝胶中实现高效分离。

各组分在电泳中的功能：

组分	浓度（1×工作液）	核心功能
Tris	25 mM	维持缓冲液pH约8.3，确保SDS-蛋白质复合物在电场中稳定迁移
甘氨酸	192 mM	前沿离子：在浓缩胶中与Cl⁻形成不连续前沿，实现蛋白样品的浓缩效应；在分离胶中作为跟随离子维持稳定电场
SDS	0.1%	补充电泳过程中消耗的SDS，维持蛋白质处于SDS饱和的负电荷状态，防止蛋白条带弥散

核心作用：SDS与β-巯基乙醇/DTT在上样缓冲液中完成蛋白变性和二硫键断裂后，本缓冲液在电泳过程中维持蛋白质的变性和电荷状态，实现分子量依赖的凝胶电泳分离。

本品为5倍浓缩液，使用时稀释至1×工作液，无需调节pH，直接使用。

SDS-PAGE电泳是基于Laemmli系统的不连续缓冲体系，两种凝胶（浓缩胶和分离胶）具有不同的pH和胶浓度：

凝胶层	pH	Tris浓度	作用
浓缩胶（Stacking Gel）	6.8	0.5 M Tris-HCl	将蛋白样品浓缩成薄层，所有蛋白在进入分离胶前集中在同一起跑线
分离胶（Resolving Gel）	8.8	1.5 M Tris-HCl	根据分子量大小分离蛋白质（小分子跑得快，大分子跑得慢）

本电泳缓冲液（pH 8.3）在整个电泳系统中维持离子环境和pH稳定，是Laemmli不连续电泳体系的第三组分（配合浓缩胶pH 6.8和分离胶pH 8.8完成完整的pH梯度）。

第一步：称量
称取15.1 g Tris 碱、94 g 甘氨酸、5.0 g SDS，置于1 L烧杯中。

第二步：加水溶解
加入约800 mL去离子水，使用磁力搅拌器温和搅拌至完全溶解。

⚠️ 避免起泡：SDS为强力发泡剂，搅拌时应温和操作，避免剧烈搅拌产生大量泡沫。若泡沫过多，静置消泡后再定容。

第三步：定容
用去离子水定容至1 L，充分混匀。溶液应为无色透明，无可见颗粒。

第四步：保存
转移至试剂瓶中，室温密封保存。

第五步：稀释使用
电泳前按1:5比例稀释（如200 mL 5×缓冲液 + 800 mL去离子水），配制成1×工作液后使用。

本配方无需调节pH，其原理如下：

组分	摩尔数（1 L中）	性质
Tris（pKa 8.06）	0.125 mol	弱碱，部分去质子化
甘氨酸（pKa 2.34/9.60）	1.25 mol	在pH 8.3下主要以两性离子形式存在

15.1 g Tris碱与94 g甘氨酸共同溶解后，溶液的pH自然平衡在约8.3。此pH是SDS-PAGE电泳的最佳工作pH，无需额外用酸碱调节，直接定容即可使用。

问题	原因	解决方法
SDS溶解缓慢	室温低，SDS溶解度受限	温和搅拌或37 ℃水浴加热助溶（避免起泡）
配制时产生大量泡沫	搅拌过于剧烈	放慢搅拌速度，静置消泡后再定容
电泳时电流异常（过高或过低）	缓冲液浓度不准确（稀释误差或定容不准）	检查稀释比例，确保定容准确
电泳过程中pH明显变化	缓冲液使用次数过多或时间过长	每块胶使用新鲜1×工作液，建议1×工作液不超过3次电泳
电泳条带模糊或拖尾	缓冲液中SDS浓度不足（被消耗）	内槽使用新鲜缓冲液，外槽可使用回收缓冲液（但内槽必须新鲜）
配制后溶液有颗粒/浑浊	SDS未完全溶解或甘氨酸纯度低	加热至37 ℃助溶；使用高纯度甘氨酸

缓冲液	Tris	甘氨酸	SDS	用途
5×储备液	0.125 M	1.25 M	0.5%	浓缩储备，室温保存
1×工作液（稀释5倍）	25 mM	192 mM	0.1%	SDS-PAGE电泳运行缓冲液