X-Gal 溶液配制指南（20 mg/mL，50 mL）

概述

X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）是蓝白斑筛选中最常用的显色底物，与IPTG配合使用，用于区分含有外源基因插入的重组质粒与未插入的载体自连产物。

X-Gal的工作原理：

步骤	说明
①	IPTG诱导lacZα基因表达产生β-半乳糖苷酶α-肽段
②	α-肽段与宿主菌基因组编码的β-半乳糖苷酶ω-肽段互补形成有活性的β-半乳糖苷酶
③	有活性的酶将X-Gal底物水解为不溶性蓝色产物（5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛蓝）
④	不含外源插入的载体（自连）：lacZα完整 → 产生蓝色菌落
⑤	含外源插入的重组载体：lacZα被破坏 → 白色菌落（阳性）

💡 X-Gal本身为无色化合物，被β-半乳糖苷酶水解后产生不溶性蓝色沉淀，在菌落中积累形成蓝色，实现直观筛选。

注意事项：

第一步：准备工作（避光+通风橱）

第二步：称量（避光操作）
在通风橱内，避光条件下称取1 g X-Gal，转移至50 mL无菌离心管中（推荐使用棕色离心管）。

第三步：溶解（避光操作）
加入约40 mL DMF，盖紧管盖，温和颠倒或低速涡旋至完全溶解（X-Gal在DMF中溶解较快，溶液应清澈透明，呈淡黄色至无色）。

第四步：定容（避光操作）
用DMF定容至50 mL，轻轻颠倒混匀。

第五步：分装（避光操作）
在避光条件下，小份分装为1 mL/份于无菌离心管中（推荐棕色管，或透明管外裹铝箔纸）。每管标注“20 mg/mL X-Gal，-20℃”及配制日期。

第六步：保存
-20 ℃避光密封保存。

组分	用量（100 mL）	终浓度
IPTG（24 mg/mL储备液）	100 μL	24 μg/mL（0.1 mM）
X-Gal（20 mg/mL储备液）	200 μL	40 μg/mL

添加顺序：

LB培养基高温高压灭菌 → 冷却至50～55 ℃ → 加入IPTG → 加入X-Gal → 充分混匀 → 倒平板

保存期限：

含IPTG/X-Gal的LB平板在4 ℃避光保存，有效期约2～4周。X-Gal光敏感，随时间显色能力下降，建议现配现用或1～2周内使用。

问题	原因	解决方法
X-Gal在DMF中溶解缓慢	加入DMF量不足或温度低	室温下温和搅拌，不可加热
配制后X-Gal溶液颜色发黄	光照或保存不当导致降解	废弃重配，确保全程避光
蓝白斑筛选没有蓝色菌落	X-Gal失效或IPTG失效	更换新鲜X-Gal和IPTG；检查保存条件
蓝色太浅或菌落呈现浅蓝色	X-Gal或IPTG浓度不足	增加X-Gal至40 μg/mL（2 mL/L），IPTG至24 μg/mL（1 mL/L）
平板背景呈浅蓝色	X-Gal加入过多或平板保存过久	减少X-Gal至20～30 μg/mL；使用新鲜倒制的平板
白色菌落比例低	X-Gal或IPTG活性下降	使用新鲜储备液；注意避光-20℃保存

⚠️ 全程避光是核心原则：X-Gal对光极为敏感，称量、溶解、分装、保存全过程必须避光。使用棕色离心管，或在透明管外包铝箔纸，操作时关闭照明灯或在暗处进行。
⚠️ 通风橱操作不可省略：DMF为有毒挥发性溶剂，全程在通风橱内操作，佩戴手套和护目镜。
⚠️ 严禁反复冻融：反复冻融会导致X-Gal降解失效，1 mL/份小份分装、取用即弃是核心保存策略。每管标注配制日期，-20℃避光保存，有效期约6～12个月。
X-Gal的溶剂选择：X-Gal不溶于水，必须使用DMF或DMSO作为溶剂。DMF溶解效果更优（X-Gal在DMF中溶解度≥40 mg/mL），是蓝白斑筛选的标准溶剂。若使用DMSO，配制浓度同样为20 mg/mL（1 g/50 mL）。
培养基添加温度：X-Gal应于LB培养基灭菌后冷却至50～55 ℃时加入，避免高温破坏X-Gal结构。
平板使用建议：含X-Gal/IPTG的平板提前配制、避光保存，使用前室温放置10～15分钟去除冷凝水。倒好的平板在4℃避光保存，建议2～4周内使用。

试剂	储备液浓度	1 L培养基用量	终浓度
IPTG	24 mg/mL	1 mL	24 μg/mL（0.1 mM）
X-Gal	20 mg/mL	2 mL	40 μg/mL