TB 培养基配制指南（1 L，含磷酸盐缓冲液）

概述

TB培养基（Terrific Broth）是一种高密度细菌培养基，由LB培养基改良而来，专为大肠杆菌高密度培养和重组蛋白高表达设计。与LB培养基相比，TB培养基含有更高浓度的酵母提取物（2.4% vs 0.5%）和甘油作为碳源，配合强效磷酸盐缓冲系统，可显著提高菌体密度（OD₆₀₀可达3～5，约为LB的2～3倍）和重组蛋白产量。

各组分功能：

组分	浓度	核心功能
Tryptone（胰蛋白胨）	1.2%	提供氮源（氨基酸、肽段），支持蛋白质合成
Yeast Extract（酵母提取物）	2.4%	提供B族维生素、核苷酸、生长因子（高浓度支持快速生长）
Glycerol（甘油）	0.4%	碳源和能量来源，较葡萄糖更稳定，无Crabtree效应（不产生有机酸副产物）
KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液	100 mL/L	维持pH 7.0～7.4，防止高密度培养中酸性代谢产物积累导致pH下降

💡 TB vs LB：LB是“通用型”培养基，适用于常规培养；TB是“高性能型”培养基，专为高密度培养和蛋白高表达设计，营养更丰富、缓冲能力更强。

核心注意事项：

磷酸盐缓冲液须单独配制灭菌，不可与基础培养基一同灭菌
灭菌后需冷却至60 ℃以下再加入缓冲液

TB vs LB 培养基详细对比

比较项	LB培养基	TB培养基（本方案）
Tryptone	1%（10 g/L）	1.2%（12 g/L）
Yeast Extract	0.5%（5 g/L）	2.4%（24 g/L，4.8倍）
碳源	无（依赖培养基中痕量糖）	0.4% Glycerol
缓冲体系	无（需手动调节pH）	磷酸盐缓冲液（强效缓冲）
典型OD₆₀₀	1.5～2.0	3.0～5.0（2～3倍）
蛋白表达产量	中等	显著提高
适用场景	常规培养、质粒扩增	高密度培养、蛋白高表达、大提质粒

所需材料

材料	规格	用量
Tryptone（胰蛋白胨）	微生物级	12 g
Yeast Extract（酵母提取物）	微生物级	24 g
Glycerol（甘油）	分析纯	4 mL
KH₂PO₄（磷酸二氢钾）	分析纯	2.31 g
K₂HPO₄（磷酸氢二钾）	分析纯	12.54 g
去离子水	超纯水	定容至1 L + 100 mL

详细操作流程

第一步：配制磷酸盐缓冲液（100 mL） ——独立操作

称取2.31 g KH₂PO₄和12.54 g K₂HPO₄，置于200 mL烧杯中。
加入约90 mL去离子水，充分搅拌至完全溶解。
加去离子水定容至100 mL，充分混匀。
转移至耐高温瓶中，高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）。
灭菌后冷却至室温，备用。

⚠️ KH₂PO₄与K₂HPO₄易吸潮，称量后及时密封试剂瓶，确保浓度精准。

第二步：配制基础培养基（1 L） ——独立操作

称取12 g Tryptone、24 g Yeast Extract，量取4 mL Glycerol，置于1 L烧杯中。

⚠️ 甘油粘稠，沿烧杯壁缓慢加入，用少量去离子水冲洗容器残留，确保完全转移。

加入约800 mL去离子水，充分搅拌至完全溶解（溶液呈浅黄色，无可见颗粒）。
加去离子水定容至1 L，充分混匀。
转移至耐高温瓶中，高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）。

第三步：混合

待基础培养基冷却至60 ℃以下（用手背触碰瓶壁感觉温热不烫手）。
在超净台内，将100 mL灭菌磷酸盐缓冲液加入基础培养基中，充分混匀。
4 ℃密封保存。

磷酸盐缓冲液单独灭菌的必要性

灭菌方式	结果
磷酸盐缓冲液+基础培养基一同灭菌	❌ 高温下磷酸盐与培养基中蛋白质、金属离子反应，产生沉淀，培养基浑浊，营养损失
磷酸盐缓冲液单独灭菌后混合 ✅	✅ 各组分独立稳定，混合后澄清透明，缓冲能力和营养成分完整保留

⚠️ 核心原则：磷酸盐缓冲液必须单独配制、单独灭菌，冷却后再与基础培养基混合。

温度控制——加入缓冲液的时机

基础培养基温度	加入缓冲液	结果
<60 ℃✅	加入缓冲液	✅ 缓冲体系稳定，培养基澄清
≥60 ℃	加入缓冲液	❌ 磷酸盐缓冲体系在高温下可能不稳定，部分缓冲盐析出
≥80 ℃	加入缓冲液	❌ 明显浑浊或沉淀，缓冲能力下降

⚠️ 核心原则：基础培养基灭菌后必须冷却至60 ℃以下再加入磷酸盐缓冲液。

常见问题与解决方案

问题	原因	解决方法
混合后培养基出现白色沉淀	1）缓冲液温度过高 2）水质硬度高	冷却至60℃以下再混合；使用超纯水；若沉淀严重则废弃重配
磷酸盐溶解缓慢	室温较低或搅拌不充分	充分搅拌，可适当加热（<50 ℃）助溶
甘油转移不完全（残留）	甘油粘稠，附着在量具壁面	用少量去离子水冲洗量具2～3次，确保完全转移
高密度培养OD达不到预期	1）缓冲液pH不准 2）营养不充分	检查缓冲液配制浓度和pH；确认Tryptone/Yeast Extract质量
灭菌后培养基颜色偏深	灭菌温度过高或时间过长	使用121 ℃ 15～20 min标准条件
蛋白表达量低于LB	1）诱导时机不当 2）抗生素失效	TB中细菌生长快，应在OD₆₀₀=0.6～0.8时诱导；使用新鲜抗生素

关键操作要点

磷酸盐缓冲液必须单独灭菌：不可与基础培养基一同灭菌，否则高温下会产生沉淀，导致培养基浑浊和缓冲能力下降。
防吸潮：KH₂PO₄与K₂HPO₄均为吸潮性粉末，称量后立即密封试剂瓶，否则吸潮后称量不准，影响缓冲液浓度和pH。
甘油完全转移：甘油粘稠度高，容易残留在量筒或移液管壁。量取后用少量去离子水冲洗容器2～3次，确保甘油完全进入培养基。
温度控制是混合关键：基础培养基灭菌后冷却至60℃以下再加入缓冲液，防止高温破坏缓冲体系稳定性。
pH自动调节：KH₂PO₄和K₂HPO₄按0.17 M:0.72 M比例混合后，培养基pH自然稳定在7.0～7.4，无需额外用NaOH/HCl调节（这也是TB培养基的便利之处）。
适用抗生素时注意：若需制备含抗生素的TB培养基（如TB/Amp），应于混合缓冲液并冷却至50～55 ℃后再加入抗生素（按LB/Amp方法）。

高密度培养操作建议

步骤	操作
①	接种单菌落至5～10 mL TB培养基（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜（种子培养）
②	按1:50～1:100比例接种至新鲜TB培养基（如1 L培养基接种10～20 mL种子液）
③	37 ℃振荡培养，OD₆₀₀可达3～5（比LB高2～3倍）
④	诱导时机：OD₆₀₀ = 0.6～1.0时加入IPTG（比LB的0.4～0.6略高）

应用场景

应用	说明
重组蛋白高表达	高密度培养获得更高蛋白产量（核心应用）
质粒DNA大量提取	高密度菌体 → 更高质粒产量
感受态细胞制备	作为高密度预培养培养基
生物发酵	工业发酵预培养