LB/Amp 培养基配制指南（1 L，含100 μg/mL Ampicillin）

概述

LB/Amp培养基是在标准LB培养基中添加氨苄青霉素（Ampicillin）的选择性培养基，用于筛选和扩增含氨苄抗性基因（如pBR322、pUC系列载体）的阳性转化子。未转化或未携带Amp抗性基因的细菌因无法降解Ampicillin而被抑制生长，从而实现阳性克隆的选择性扩增。

Ampicillin的作用机制：

💡 Amp抗性筛选的关键挑战：β-内酰胺酶被分泌到培养基中后，会降解周围的Ampicillin，导致“卫星菌落”现象。因此，筛选时间不宜过长（<16小时），且培养基中Ampicillin浓度需维持在100 μg/mL。

核心注意事项：

第一步：配制基础LB培养基

第二步：灭菌

第三步：冷却

第四步：添加抗生素

第五步：保存

⚠️ 核心原则：Ampicillin为热敏感抗生素，必须在培养基冷却至室温后方可添加。若在高温时加入，β-内酰胺环被破坏，Ampicillin完全失效。

问题	原因	解决方法
平板上长出大量小菌落（卫星菌落）	Ampicillin浓度不足或β-内酰胺酶降解	使用新鲜Ampicillin；终浓度100 μg/mL；筛选时间≤16小时
转化子筛选效率极低	Ampicillin浓度过高（>100 μg/mL）或Ampicillin失效	使用标准浓度100 μg/mL；检查Ampicillin储备液有效性
培养基加入Ampicillin后浑浊	Ampicillin母液污染或培养基未冷却	废弃，检查Ampicillin储备液无菌状态
4℃保存3天后菌落筛选效果下降	Ampicillin降解（Ampicillin在LB培养基中不稳定）	现配现用，不超过3天；不宜长期保存
液体LB/Amp接种后细菌不生长	Ampicillin浓度过高或Ampicillin未完全混匀	确保1 mL/L标准用量，充分混匀
Ampicillin平板长出的菌落为蓝色（非白色）	X-gal/IPTG未正确添加或lacZα未破坏	检查蓝白斑筛选体系；确保外源基因正确插入

⚠️ Ampicillin必须在培养基冷却至室温后添加：高温破坏β-内酰胺环，导致抗生素失效。加药前用手背触碰瓶壁确认不烫手（≤40 ℃）。
⚠️ 全程超净台无菌操作：加药操作须在超净台内进行，使用无菌移液管/吸头，防止母液和培养基污染。
⚠️ 有效期严格管理：含Ampicillin的培养基4 ℃保存有效期不超过3天。Ampicillin在LB培养基中稳定性较差（β-内酰胺环在水溶液中缓慢水解），应现配现用。
⚠️ 污染判断：若培养基出现浑浊、沉淀或絮状物，说明已污染，需立即弃用，不可再次灭菌（高温会降解Ampicillin且无法杀死某些耐热微生物）。
筛选时间控制：含Ampicillin的平板37 ℃培养时间不超过16小时（过夜即可）。时间过长，β-内酰胺酶积累会导致卫星菌落出现，干扰筛选。
液体培养基使用时添加抗生素：液体LB/Amp培养基同样建议使用前加入Ampicillin（而非配制时提前加入），以最大限度保持抗生素活性。

步骤	操作
①	配制LB培养基时加入15 g琼脂粉/L
②	高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）
③	冷却至50～55 ℃（较液体培养添加温度可略高，但加Amp前仍需冷却至≤40℃）
④	在超净台内加入1 mL Ampicillin（100 mg/mL），充分混匀
⑤	倒平板（约15～20 mL/皿，90 mm培养皿）
⑥	室温凝固后4 ℃避光倒置保存（有效期2～3周）