TB/Amp 培养基配制指南（1 L，含100 μg/mL Ampicillin）
概述
TB/Amp培养基是在TB培养基（Terrific Broth） 基础上添加氨苄青霉素（Ampicillin） 的选择性高密度培养基，兼具TB培养基的高密度培养优势和Ampicillin的筛选压力，专用于含氨苄抗性质粒的高密度培养和重组蛋白高表达。
TB/Amp的核心优势：
| 优势 | 说明 |
|---|---|
| 高密度培养 | 菌体密度OD₆₀₀可达3～5（LB/Amp的2～3倍） |
| 高蛋白产量 | 丰富营养和高效缓冲支持更高水平的蛋白表达 |
| 高效筛选 | Ampicillin维持选择压力，确保质粒稳定性 |
| pH稳定 | 磷酸盐缓冲液防止高密度培养中pH下降 |
核心注意事项：
Ampicillin不耐高温，须在培养基冷却至60 ℃以下后加入
磷酸盐缓冲液须单独灭菌，不可与基础培养基一同灭菌
含药培养基4 ℃保存有效期不超过3天
TB/Amp vs LB/Amp 培养基对比
| 比较项 | LB/Amp培养基 | TB/Amp培养基（本方案） |
|---|---|---|
| Tryptone | 10 g/L | 12 g/L |
| Yeast Extract | 5 g/L | 24 g/L（4.8倍） |
| Glycerol | 无 | 4 mL/L（0.4%） |
| 缓冲体系 | 无 | 磷酸盐缓冲液（100 mL/L） |
| Ampicillin | 100 μg/mL | 100 μg/mL |
| 典型OD₆₀₀ | 1.5～2.0 | 3.0～5.0（2～3倍） |
| 蛋白表达量 | 中等 | 显著提高 |
| 保存期 | ≤3天 | ≤3天 |
| 适用场景 | 常规Amp筛选 | Amp筛选+高密度培养+高表达 |
所需材料
| 材料 | 规格 | 用量 |
|---|---|---|
| Tryptone（胰蛋白胨） | 微生物级 | 12 g |
| Yeast Extract（酵母提取物） | 微生物级 | 24 g |
| Glycerol（甘油） | 分析纯 | 4 mL |
| KH₂PO₄（磷酸二氢钾） | 分析纯 | 2.31 g |
| K₂HPO₄（磷酸氢二钾） | 分析纯 | 12.54 g |
| Ampicillin（100 mg/mL储备液） | 无菌，-20℃保存 | 1 mL |
| 去离子水 | 超纯水 | 定容至1 L + 100 mL |
详细操作流程
第一步：配制磷酸盐缓冲液（100 mL）
称取2.31 g KH₂PO₄和12.54 g K₂HPO₄，置于200 mL烧杯中。
加入约90 mL去离子水，充分搅拌至完全溶解。
加去离子水定容至100 mL，充分混匀。
高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min），冷却至室温备用。
⚠️ KH₂PO₄与K₂HPO₄易吸潮，称量后及时密封试剂瓶，精准控制用量以保证缓冲浓度。
第二步：配制基础培养基（1 L）
称取12 g Tryptone、24 g Yeast Extract，量取4 mL Glycerol，置于1 L烧杯中。
⚠️ 甘油具粘稠性，沿烧杯壁缓慢滴加，用少量去离子水冲洗容器残留2～3次，确保完全转移。
加入约800 mL去离子水，充分搅拌至完全溶解。
加去离子水定容至1 L，充分混匀。
高温高压灭菌（121 ℃，15～20 min）。
第三步：冷却与加药
待基础培养基冷却至60 ℃以下（用手背触碰瓶壁感觉温热不烫手）。
在超净台内无菌操作，加入100 mL灭菌磷酸盐缓冲液和1 mL Ampicillin（100 mg/mL）。
充分混匀后4 ℃密封保存。
Ampicillin添加的温度要求
| 添加温度 | Ampicillin活性 | 结果 |
|---|---|---|
| ≤60 ℃✅ | 稳定，活性保留 | ✅ 正常筛选效果 |
| 60～70 ℃ | 部分降解 | ⚠️ 筛选效率下降 |
| ≥80 ℃ | β-内酰胺环破坏 | ❌ 抗生素失效，筛选无效 |
⚠️ Ampicillin不耐高温，严禁在高温时加入，必须在培养基冷却至60 ℃以下后于超净台内无菌操作添加。
常见问题与解决方案
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 混合后培养基出现白色沉淀 | 磷酸盐缓冲液温度过高或水质硬度高 | 冷却至60℃以下再混合；使用超纯水 |
| 高密度培养OD达不到预期 | 缓冲液pH不准或营养不足 | 检查缓冲液配制浓度和pH；确认原料质量 |
| 平板上出现卫星菌落 | Ampicillin浓度不足或降解 | 使用新鲜Ampicillin储备液；终浓度100 μg/mL |
| 蛋白表达量低于预期 | 1）诱导时机不当 2）Ampicillin失效 | TB中生长快，OD₆₀₀=0.6～1.0时诱导；确认Amp有效 |
| 4℃保存3天后筛选效果下降 | Ampicillin降解 | 现配现用，不超过3天 |
| 培养基出现浑浊或沉淀 | 微生物污染 | 立即弃用，检查无菌操作流程 |
高密度培养操作建议
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| ① | 接种单菌落至5～10 mL TB/Amp培养基，37 ℃振荡培养过夜（种子培养） |
| ② | 按1:50～1:100比例接种至新鲜TB/Amp培养基 |
| ③ | 37 ℃振荡培养，OD₆₀₀可达3～5 |
| ④ | 诱导时机：OD₆₀₀ = 0.6～1.0时加入IPTG |
关键操作要点
⚠️ 磷酸盐缓冲液单独灭菌：不可与基础培养基一同灭菌，否则高温下会产生沉淀，导致培养基浑浊和缓冲能力下降。
⚠️ Ampicillin冷却后添加：必须在培养基冷却至60 ℃以下后加入，加药全程在超净台内无菌操作，防止母液污染及活性丧失。
⚠️ 防吸潮：KH₂PO₄与K₂HPO₄易吸潮，称量后立即密封试剂瓶，确保浓度精准。
⚠️ 甘油完全转移：甘油粘稠，沿烧杯壁缓慢滴加，用少量去离子水冲洗容器残留以确保完全转移。
⚠️ 有效期管理：含Ampicillin的TB培养基4 ℃保存有效期不超过3天。若出现浑浊、沉淀，需立即弃用。Ampicillin在水溶液中稳定性较差，应现配现用。
⚠️ 筛选时间控制：含Ampicillin的平板37 ℃培养时间不超过16小时（过夜即可），时间过长会出现卫星菌落。
应用场景
| 应用 | 说明 |
|---|---|
| 含Amp抗性质粒高密度培养 | 高密度扩增含Amp质粒的菌株（核心应用） |
| 重组蛋白高表达（Amp筛选） | 高密度培养+IPTG诱导，蛋白产量优于LB/Amp |
| 质粒DNA大量提取 | 高密度菌体→更高质粒产量 |
| TB/Amp平板筛选 | 高密度转化子筛选 |
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